2. COLECTA Y VALORACIÓN SEMINAL
José A. García-Paloma
Agustín Oliet Palá
Sonia Pérez Garnelo
Si pretendemos que el juicio emitido sobre una muestra de semen refleje lo más fielmente posible la valoración de un toro por su calidad seminal, tan importante es que la muestra obtenida sea representativa, como que se controlen los factores poscolecta que pueden alterar las valoraciones de los parámetros analizados. En este capítulo haremos mención entre otros factores, al método de colecta, a los riesgos de contaminación de la muestra, a la temperatura ambiente, a la manipulación del semen, así como a los protocolos empleados para su valoración.
2.1. Métodos de colecta
2.1.1. Colecta de semen por electroeyaculación
La colecta de semen en campo no es compatible con el adiestramiento previo del toro al método más habitual, el basado en la vagina artificial. La técnica más contrastada y la que recomiendan los sistemas BBSE de referencia es la electroeyaculación (Barth, 2013; Beggs, 2013; Koziol and Armstrong, 2018). Cabe mencionar que el protocolo aquí descrito se ha desarrollado con toros jóvenes y de fácil manejo. Por tanto, estas pautas pueden requerir alguna modificación cuando la colecta se realice en toros con otra edad o temperamento.
Con el toro ya retenido en la manga se procede a la limpieza de la zona prepucial: corte de pelo, lavado interno con suero fisiológico o con una solución de ClNa al 0,9% atemperada a 37°C y secado de la zona con papel limpio y desechable. Si tras el lavado el toro llegara a orinar, se volverá a repetir el procedimiento. Es importante evitar la presencia de orina en prepucio, sobre todo cuando el semen se emite por goteo por no acompañarse de erección.
En el mercado hay diferentes equipos de electroeyaculación. Todos los modelos cuentan con una sonda que colocada vía rectal transmite de forma controlada impulsos de bajo voltaje y de intensidad creciente a los nervios pélvicos. En todo momento la intensidad del impulso se puede frenar para mantenerla fija, como también aumentarla para adaptarse a la sensibilidad y a la variabilidad de respuesta de cada toro. El porcentaje de éxito en la obtención de una muestra de semen suele ser superior al 90%. El voltaje necesario para una colecta exitosa varía con el toro, así como también los síntomas colaterales que en un grado leve se suelen manifestar. El síntoma más común que se suele presentar durante la sesión de colecta es la contracción muscular generalizada que en ocasiones se traduce en la extensión de una extremidad posterior. Algunos toros presentan un umbral de sensibilidad superior (5-10% de los casos) manifestando flexión de extremidades, vocalización o mugido; en estos casos consideramos que el toro muestra rechazo al procedimiento e interrumpimos la colecta. Tras el paso de un tiempo prudencial de 30 minutos se puede volver a repetir la colecta con otras alternativas como el masaje rectal de las ampollas del conducto deferente o la electroeyaculación acompañada de sedación. Si tras este nuevo intento no se consiguiera una muestra de semen, se recomienda repetir la colecta una semana más tarde.
Los equipos de electroeyaculación suelen aportar un colector con mango como el que se muestra en la Figura 13. El problema que puede surgir con este tipo de colector es que ante una temperatura ambiente media-baja, el semen puede sufrir un choque térmico cuando descienda por el embudo y por el tubo de colecta afectando a su motilidad espermática. Para controlar este efecto se diseñó una vagina colectora atemperable como la que se presenta en la Figura 13 (García-Paloma, 2017; comunicación personal). En este diseño, tanto el embudo de colecta como el tubo colector se atemperan con agua a 45-50°C en función de la temperatura ambiente. El embudo de colecta puede ser descartable o reutilizable de látex o de silicona. Cuando se prevea una demora entre la preparación de la vagina colectora y la colecta, se aconseja la utilización de fundas térmicas. En el diseño de la vagina colectora aparece cortado el mango para un control más preciso de la colecta, sobre todo cuando el toro se mueve mucho durante la sesión. No obstante, ante toros bravos, nerviosos o mangas de manejo poco funcionales para este cometido, el mismo diseño de vagina colectora manteniendo el mango sería el de elección.
Figura 13. Colector comercial y diseño de vagina colectora atemperable
Antes de colocar la sonda en recto, se procede a evacuar las heces evitando la entrada de aire y a efectuar un masaje ligero del suelo pélvico con la finalidad de conseguir una adecuada relajación del toro y una buena transmisión del impulso desde la sonda a los nervios pélvicos. Con el fin de aumentar la probabilidad de conseguir una muestra de semen representativa, el sistema de colecta que se va a describir a continuación contempla la utilización de dos vaginas colectoras y la obtención de dos muestras en la misma sesión (Figura 14). Iniciado el proceso de estimulación, dejamos que la intensidad del estímulo vaya subiendo hasta que apreciemos una ligera turbidez en el semen emitido por goteo a través del prepucio o la erección de pene. Llegados a este punto, con la primera vagina empezamos el proceso de colecta, y de forma controlada y en función de la respuesta del toro, vamos subiendo pulso a pulso el nivel de estimulación hasta que veamos que en el tubo de colecta la densidad espermática aumenta. En este momento frenamos la intensidad del estímulo y colocamos la segunda vagina colectora. Si se viera que la emisión de semen cesa, se subirá el estímulo hasta lograr al menos una colecta de 2 ml. Cuando lo colectado sea mayoritariamente plasma seminal, la colecta puede ser repetida pasados unos minutos. Conseguida la colecta y hasta el momento de su valoración, se han de poner los medios necesarios para que la temperatura del semen no descienda por el efecto de la temperatura ambiente.
Figura 14. Colecta de semen con la obtención de dos muestras
2.1.2. Colecta de semen por electroeyaculación con analgesia o sedación
Para disminuir el grado de los síntomas que manifiestan algunos toros ante el estímulo recibido por la electroeyaculación, se han probado dos estrategias de acompañamiento: la anestesia epidural y la sedación. La anestesia epidural con 6 ml de lidocaína al 2% tiende a disminuir parámetros relacionados con el estrés como el cortisol y la progesterona, aunque las diferencias con los toros que no la recibieron no fueron significativas (Falk et al., 2001; Etson et al., 2004). En este tipo de anestesia también se ha de considerar el posible estrés que se le puede causar al toro por el simple hecho de su aplicación.
La utilización de xilacina vía IV a dosis de sedación (0,033 mg de hidrocloruro de xilacina/kg PV), disminuye la frecuencia cardiaca como parámetro relacionado al estrés, pero los efectos secundarios que a veces se presentan como ataxia y postración no hacen muy aconsejable su uso (Mosure et al., 1998).
Banzo Ferrer, Grupo VART (2018; comunicación personal), utiliza de forma sistemática la sedación con xilacina vía IV antes de proceder a la colecta de semen por electroeyaculación con una dosis media 0,02 mg/kg PV. La dosis recomendada se reduce un 50% en toros tranquilos o se incrementa en el mismo porcentaje cuando se trata de toros nerviosos o de fuerte temperamento. Con estas dosis inferiores a la utilizada por Mosure no se evidencian los efectos secundarios antes mencionados de ataxia y postración.
2.1.3. Colecta de semen por masaje rectal
Esta técnica consiste en aplicar vía rectal un masaje con movimientos cráneo-caudales de los dedos índice, medio y anular sobre las ampollas del conducto deferente. El semen se libera desde las ampollas y se exterioriza goteando a través del prepucio al no acompañarse, generalmente, de erección (Palmer, et al., 2005). En esta técnica, el corte de pelo y el lavado prepucial previo a la colecta se considera indispensable para evitar la obtención de muestras contaminadas. La técnica tiene un 80-95% de éxito en la colecta cuando el toro se encuentra relajado y se realiza por un profesional experto (Palmer, 2005; Sylla et al. 2015). Al comparar este método con el método de electroeyaculación se observó que el semen obtenido por masaje rectal tuvo un menor porcentaje de espermatozoides vivos, menor porcentaje de mótiles progresivos y similar porcentaje de espermatozoides morfológicamente normales (Palmer, et al., 2005).
En nuestra práctica de colecta por este procedimiento nos hemos encontrado con muestras de semen con baja motilidad masal que revirtieron a una buena motilidad progresiva cuando se diluyeron con un medio de criopreservación (García-Paloma, 2018; comunicación personal). La razón puede estar en el aporte de componentes esenciales para la cinética espermática ausentes en un plasma seminal proveniente de una secreción no fisiológica de las glándulas sexuales accesorias (Aitken, 2000); de hecho, Kastelic et al. (2012) consideran al semen colectado por masaje rectal como una emisión más que una verdadera eyaculación.
En una valoración comparativa de los sistemas de colecta alternativos a la electroeyaculación (vagina artificial, masaje rectal, o electroeyaculación acompañada con oxitocina, prostaglandina, analgesia o sedación), Palmer (2005) concluyó que, aunque puede haber ciertas ventajas en alguna de ellas, la colecta de semen por electroeyaculación sin acompañamiento medicamentoso es el sistema de elección por la mayor uniformidad y calidad seminal de las muestras obtenidas. No obstante, como ya mencionamos anteriormente, en toros que muestran rechazo a la electroeyaculación, o en los que no ha sido posible la colecta de semen por este procedimiento, el masaje rectal de las ampollas del conducto deferente o la electroeyaculación acompañada con sedación se consideran buenas alternativas.
2.2. Protocolos de valoración seminal
En esta fase de la metodología BBSE, se debe poner énfasis en el control de los factores que pueden influir sobre los parámetros de calidad seminal evaluados; entre estos factores se destacan: 1) el mantenimiento a una temperatura en torno a los 37°C del semen, de los medios y de todo aquello que vaya a entrar en contacto con él; 2) el tiempo transcurrido entre la colecta y la valoración; 3) la suave y reiterada homogeneización de la muestra de semen antes de cualquier dilución; 4) la experiencia y la formación técnica del evaluador y 5) los protocolos utilizados.
El mayor control de estos factores se consigue cuando la valoración seminal se hace inmediatamente después de la colecta. De hecho, éste es el procedimiento que se recomienda en todos los sistemas BBSE que tenemos de referencia. En España donde la metodología para valorar la ApR de los toros lleva pocos años de aplicación, está muy arraigado el escenario en el que los veterinarios colectan el semen en campo y su valoración se posterga hasta la llegada de las muestras a su laboratorio o a uno de referencia. Aun admitiendo que la precisión con la que se valora la calidad seminal es menor en este segundo escenario, en la guía contemplamos dos protocolos diferenciados para ambas situaciones: Protocolo 1 (valoración seminal en campo) y Protocolo 2 (valoración seminal en laboratorio).
2.2.1. Protocolo 1, valoración seminal en campo
Existen numerosos protocolos de valoración seminal en campo y por lo general, con diferencias que dificultan la obtención de datos comparables. El protocolo que aquí se describe es una adaptación basada en las cuatro principales guías que actualmente tenemos de referencia (Barth, 2013; Beggs, 2013; Koziol and Armstrong, 2018; Penny, 2018) y en todo momento hemos tenido presente aquellos aspectos que pueden facilitar su ejecución en campo y su adaptación a la diversidad de entornos ganaderos de nuestro país.
En este protocolo los veterinarios realizan en campo la valoración seminal conducente a la obtención de la motilidad espermática progresiva y una preparación seminal para la valoración posterior de la morfología espermática en su laboratorio o en uno de referencia.
2.2.1.1. Equipamiento
El equipamiento para la valoración seminal en campo debe ser lo más reducido posible en razón a su operatividad y coste, pero a su vez, contrastado para valorar los parámetros seminales con la precisión exigible por la metodología BBSE. Una alternativa de equipamiento básico se presenta en la Figura 15.
Figura 15. Equipamiento básico para valoración seminal
Microscopio. El microscopio es el elemento más importante del equipamiento; la calidad de su óptica, el conocimiento de sus ajustes y su buen mantenimiento, son aspectos esenciales a tener en cuenta. Como características deseables del microscopio destacamos: ocular 10X, platina térmica, contraste de fase, objetivos 10X y 100X de campo claro para valorar la motilidad masal (MM) y la morfología espermática, respectivamente y objetivos 20X o 40X de contraste de fase en función del preferido para valorar la motilidad espermática progresiva (MP). Cuando la valoración de la morfología espermática se haga en laboratorios de referencia sobre muestras fijadas en glutaraldehído, el microscopio que recomienda la ACV australiana es el de interferencia diferencial de contraste (DIC, Beggs, 2013).
Incubador para mantener a 37°C los diferentes microtubos de 2 ml donde se dispensará: la muestra de semen, los medios Bioxcell, PBS, sus correspondientes diluciones “D”, así como el colorante eosina nigrosina o el medio fijador con glutaraldehído (Figura 16). Bioxcell se menciona como una opción de diluyente de crioconservación para valorar la MP y se mantendrá como tal en el documento, lo cual no excluye que otros diluyentes como Andromed también puedan ser utilizados. El diluyente PBS ajustado a 7,2 de pH se propone para valorar la morfología espermática, ya que al carecer de los componentes propios de los diluyentes de crioconservación como la glicerina, posibilita una mejor penetración de la eosina a través de la membrana plasmática en los espermatozoides que la tienen alterada (“muertos”) y una mejor diferenciación con aquéllos que la tienen íntegra (“vivos”).
Figura 16. Incubador con los microtubos para dispensar el semen, los medios y las diluciones
Micropipetas, una para diluciones mayores (100-1.000 µl), y otra para diluciones menores (0,5-10 µl) o (2-20 µl), preferiblemente la primera.
Termo para mantener agua a 45-50°C con la que atemperar las vaginas colectoras.
Cuando la actividad se incrementa respecto al número de toros a valorar en un mismo lugar, se justifica una inversión adicional en equipamiento para ganar en comodidad y en rapidez a la hora de aplicar los procedimientos. Sería el caso del equipamiento a instalar en un laboratorio móvil o en un Centro de Testaje. En la Figura 17 se muestra la incorporación de dos placas térmicas para atemperar el material de valoración y una pipeta electrónica 100-1.000 µl para automatizar las diluciones.
Figura 17. Placas térmicas y pipeta electrónica como complemento al equipamiento básico de valoración seminal
2.2.1.2. Valoración de la motilidad espermática masal y la concentración
Antes de la estimación de estos dos parámetros, se debe observar el aspecto del semen en cada uno de los dos tubos de colecta por si se aprecia contaminación por tierra, heces, orina, o la presencia de sangre o de material purulento.
Procedimiento: de cada tubo de colecta se depositan dos alícuotas de 7 µl sobre un cubre y éste se coloca invertido sobre un porta excavado donde se valorará la MM y la concentración en gota pendiente a 100X en campo claro. El porta excavado, fácilmente construido con piezas recortadas, pegadas y separadas entre sí lo suficiente para asegurar un buen apoyo del cubre, retarda la desecación de las alícuotas y mantiene durante más tiempo unas condiciones uniformes de valoración (Figura 18).
Figura 18. Valoración de la motilidad espermática masal
El valor de la MM en una muestra de semen es el resultado de la interacción de tres parámetros: la concentración espermática, su motilidad progresiva y su velocidad de progresión. La evaluación se hace de forma subjetiva aplicando una escala numérica de 1 a 5 o su correspondiente equiparación cualitativa: mala, regular, buena, muy buena o excelente. Se observará el vigor de las ondas espermáticas cuando el semen tiene una alta concentración o simplemente el movimiento espermático en caso contrario. La MM es la primera impresión que recibimos sobre la calidad de una muestra de semen, pero no se considera un parámetro discriminante en la metodología BBSE por su naturaleza imprecisa y poco concluyente. A modo de ejemplo, podemos llegar a sobreestimar la calidad de una muestra de semen por la simple visualización de ondas espermáticas cuando coincide una alta concentración y un moderado porcentaje de espermatozoides progresivos con alta velocidad. Tras la valoración de la MM en las dos muestras, sobre la mejor y sobre las mismas alícuotas procederemos a estimar su concentración. Con el fin de evitar las hiperdiluciones, a similitud de MM entre las dos muestras escogeremos la de menor concentración.
El semen colectado por electroeyaculación no solamente suele tener menor concentración espermática si lo comparamos con el colectado por el método de vagina artificial, sino que además, presenta una elevada variabilidad cuando se comparan colectas de un mismo toro. Por tal motivo, excepto en los casos de azoospermia o de oligospermia (<100×106 esp/ml), en la metodología BBSE la concentración espermática no se considera un parámetro discriminante; de hecho, el potencial de producción espermática de un toro se asocia más al tamaño de su CE que a la concentración de la muestra colectada. Aún así, una estimación de la concentración es necesaria para tener un criterio de dilución que nos permita valorar individualmente a los espermatozoides tanto por su motilidad como por su morfología. En la Tabla 5 se presenta el criterio propuesto por Entwistle and Fordyce (2003) para estimar la concentración espermática en función del aspecto del semen en el tubo de colecta o de su apreciación al microscopio en gota pendiente. Definido el rango de concentración por este criterio, hemos de decidir una cifra estimativa para proceder a su dilución posterior. En el caso de que se opte por la elaboración de dosis seminales, sí será necesario hacer un cálculo preciso de la concentración espermática utilizando un espectrofotómetro o una cámara de conteo.
Tabla 5. Estimación de la concentración espermática en función del aspecto del semen en el tubo de colecta o de su apreciación al microscopio en gota pendiente
En el microtubo “Semen” del incubador se deposita una muestra diluida con Bioxcell (semen:diluyente) en la proporción 1:1 si la concentración estimada es ≤ 1.000×106 esp/ml, o 1:3 en caso de ser mayor. El objetivo de esta primera dilución es evitar hiperdiluciones posteriores y aportar nutrientes en previsión de un plasma seminal deficitario que pueda condicionar la motilidad progresiva en el momento de la valoración.
Diluciones
Para valorar los parámetros MP y morfología espermática, en los microtubos “D” del incubador se hacen diluciones adicionales con Bioxcell y PBS a una misma concentración estimada de 50 x106 esp/ml utilizando la siguiente fórmula,
Ci x Vi = Cf x Vf
donde, Ci es la concentración estimada del microtubo “Semen” considerando ya su primera dilución; Vi la alícuota que se toma del microtubo “Semen”, siempre 100 µl; Cf la concentración final de la dilución, siempre 50×106 esp/ml y Vf el volumen final dispensado en el microtubo “D” cuyo cálculo en µL queda simplificado como Vf = Ci x 2. Se recomienda depositar primero el volumen del diluyente (Vf-100) y después los 100 µl del microtubo “Semen”.
2.2.1.3. Valoración de la motilidad espermática progresiva
Debido a la naturaleza imprecisa y poco concluyente de la MM, se requiere que la motilidad espermática se valore de una manera más individualizada a través de la MP, un parámetro que la metodología BBSE sí considera discriminante en la valoración de la aptitud reproductiva del toro.
Procedimiento: del microtubo “D” de Bioxcell se depositan dos alícuotas de 7 µl sobre un porta (Lenz et al., 2011; Nöethling and dos Santos, 2012) y sobre cada una de ellas, se deja caer suavemente y en movimiento paralelo al porta, un cubre de 22 x 22 mm. La MP se valora en contraste de fase a 200X o a 400X, en porcentaje a una precisión del 10% sobre campos situados en la zona central del cubre y calculando el valor medio de ambas alícuotas. Como este parámetro es discriminante en la metodología BBSE, cuando la MP estimada esté por debajo del umbral considerado para un semen Apto o cuando la diferencia entre las dos alícuotas supere el 10%, se repetirá el procedimiento de valoración. Para esta repetición se aconseja la utilización de una cámara tipo Makler, una alternativa mucho más precisa dada la mayor uniformidad que presentan los campos con independencia de si se observan en la periferia o en el centro de la cámara (Figura 19).
Figura 19. Valoración de la motilidad progresiva entre porta y cubre y con cámara Makler
Criterio de valoración
En el criterio para valorar la MP es donde mayor diversidad encontramos entre los sistemas BBSE de referencia, de manera que un toro Apto para un sistema puede no serlo para otro (Figura 20).
Figura 20. Umbrales de motilidad espermática progresiva según diferentes sistemas de valoración
El sistema SFT es el que propone el umbral menos exigente de MP para calificar a un toro como Apto (30%), mientras que los sistemas WCABP y BCVA son los más rigurosos y establecen el umbral en el 60%. Como sistema alternativo a los anteriores, el ACV propone la categoría intermedia Aceptable (30-60%) para definir a los toros que se quedan un poco por debajo del umbral definido para la categoría Apto, y a sabiendas que su fertilidad puede ser menor, son admitidos como reproductores para monta natural, aunque excluidos para los Centros de Inseminación Artificial (Fordyce et al., 2006). Para esta guía adoptamos los criterios propuestos por el sistema ACV, considerando que los toros de la categoría Aceptable son perfectamente válidos para muchas de nuestras ganaderías extensivas donde la exigencia reproductiva suele ser baja.
2.2.1.4. Valoración de la morfología espermática
La técnica más habitual para valorar la morfología espermática en los sistemas BBSE es la tinción de una muestra seminal con eosina nigrosina y es la que aquí describimos. Sin embargo, el sistema australiano ACV plantea la fijación de muestras de semen con glutaraldehído al 0,2% sobre una solución salina tamponada (PBS) y su análisis obligado en laboratorios de referencia (Entwistle and Fordyce, 2003; Beggs, 2013).
Con la técnica de eosina nigrosina se puede valorar la morfología de los espermatozoides y además, la distinción entre aquéllos que tienen la membrana plasmática alterada permitiendo su coloración por la entrada de eosina en su interior “muertos” y aquellos que la tienen íntegra (“vivos”). A través de estas valoraciones, la viabilidad espermática entendida como el porcentaje de espermatozoides con integridad de membrana que a su vez no tienen anomalías estructurales, podría proponerse como un nuevo parámetro de calidad seminal en la metodología BBSE por una supuesta mayor relación con la fertilidad que la simple normalidad espermática. Mientras no se disponga de unos umbrales de referencia para valorar la calidad seminal a través de este nuevo parámetro, para la guía que ahora presentamos la viabilidad espermática no será considerada.
En la técnica de eosina nigrosina, la composición del colorante, el procedimiento de elaboración, su osmolaridad, pH, el diluyente seminal empleado y el tiempo en que el colorante interactúa con el semen antes de la realización del frotis, son entre otros, factores que pueden influir en la calidad de la tinción, en la precisión para valorar la morfología espermática y en la diferenciación entre espermatozoides vivos y muertos. Las consideraciones hechas a este respecto por Barth y Oko (1989) son las que recomiendan los principales sistemas BBSE y las que incorporamos en el siguiente procedimiento de valoración.
Procedimiento: sobre el borde de un porta colocado sobre una platina o placa térmica y en su parte central, se deposita una gota de 10 µl de la dilución “D” de PBS y sobre ésta, otra gota de 10 µl de eosina-nigrosina. Con la misma punta de la pipeta se homogeneizan ambas gotas durante 45 segundos, se extiende la mezcla a lo ancho del porta y con otro de borde biselado se hace el frotis utilizando una inclinación de 45° (Figura 21). La tinción se dejará secar sobre la platina o placa térmica, y antes de colocar el porta en la caja de transporte, se recomienda su observación a 200X en campo claro para verificar la calidad de la tinción y para seleccionar una zona apta para la valoración por sus características de concentración y contraste. Para proteger esta zona se recomienda dejar caer un cubre sobre una gota de un medio de montaje anhidro para microscopía; a nosotros nos ha dado mejor resultado una gota de aceite de inmersión (García-Paloma, 2020; comunicación personal).
Figura 21. Frotis con eosina-nigrosina sobre platina térmica
La morfología espermática se valora por duplicado a 1.000X, en campo claro utilizando aceite de inmersión. Sobre 100 espermatozoides se anotan aquéllos con morfología normal y los que tienen alguna anomalía. Si la normalidad espermática de las dos valoraciones difiere por encima del 10% se hace una tercera antes de calcular su valor medio. En base a los sistemas BBSE canadiense y australiano (Barth and Oko, 1989; Beggs, 2013), en la Tabla 6 se muestran los grupos y tipos de anomalías espermáticas que se proponen para esta guía. Entre paréntesis figura el nombre como son conocidas internacionalmente algunas tipologías. A su vez, las anomalías se distinguen entre compensables y no compensables, es decir, aquéllas donde la mejora de fertilidad es posible o compensable por un incremento en la cantidad de espermatozoides que un toro aporta en su eyaculado, y aquéllas donde la mejora de fertilidad por el aumento en el número de espermatozoides no es posible (Barth, 2000; Entwistle and Fordyce, 2003; Penny, 2018). Las anomalías compensables dificultan a los espermatozoides su capacidad para progresar y atravesar las barreras del tracto reproductor femenino como el cérvix o la unión útero tubárica. Sin embargo, los espermatozoides con anomalías no compensables pueden llegar a la zona pelúcida, bloquear a otros espermatozoides en su intento por penetrar y fertilizar al ovocito en un proceso que sin embargo siempre acabará degenerando. Por este diferente comportamiento, las anomalías no compensables siempre tendrán un mayor impacto sobre la fertilidad del toro que las anomalías compensables. Muchas de las anomalías no compensables están asociadas a problemas de DNA y/o de la cromatina, pero al requerir métodos más sofisticados para su valoración no se contemplan en la metodología BBSE.
Por último, cuando un espermatozoide es portador de varias anomalías, somos partidarios de escoger solamente una (Hoflack et al., 2006). En el caso de que coincida una anomalía compensable con otra no compensable, siempre se escogerá la primera debido a que ésta nunca permitirá al espermatozoide que la anomalía no compensable llegue a desencadenar sus efectos.
Tabla 6. Anomalías contempladas en la valoración de la morfología espermática
En la Figura 22 sobre una tinción de eosina nigrosina se aprecia la estructura en dos tipos de espermatozoide de toro, uno con la membrana citoplasmática alterada y otro con la membrana intacta.
Figura 22. Morfología del espermatozoide de toro
En la Figura 23 se presentan imágenes con diferentes anomalías espermáticas.
Figura 23. Anomalías espermáticas por orden de izquierda a derecha: cola enrollada, cabeza con vacuolas, pieza intermedia con reflejo distal, gota citoplasmática proximal y distal
Criterio de valoración
La normalidad es el parámetro discriminante elegido para valorar la morfología espermática en la metodología BBSE. Aunque se observa mayor uniformidad de criterio entre los diferentes sistemas BBSE cuando se valora la normalidad espermática que cuando se valora la MP, también se aprecian discrepancias. Los sistemas SFT, WCABP y BCVA son los más estrictos al descartar a los toros con menos del 70% de normalidad espermática, mientras que el sistema ACV es menos riguroso al proponer un umbral de descarte del 50% y la categoría intermedia Aceptable para los toros con normalidad espermática entre el 50% y el 70% (Figura 24).
Al igual que expusimos para la MP, optamos por las tres categorías del sistema ACV para valorar la normalidad espermática en nuestra propuesta de guía. Adicionalmente, también proponemos los umbrales de descarte que el sistema ACV plantea para cada una de las anomalías no compensables (> 20%) y para cada una de las anomalías compensables (> 30%).
Figura 24. Umbrales de normalidad espermática según varios sistemas de valoración
2.2.2. Protocolo 2, valoración seminal en laboratorio
Este protocolo contempla que los veterinarios realicen en el campo la recogida de semen, diluyan en Bioxcell las dos muestras colectadas (semen:diluyente) 1:1, y las transporten en refrigeración hasta su laboratorio o hasta uno de referencia para que sean valoradas antes de que transcurran 24 horas de la colecta. Además, si el laboratorio de referencia analizara la morfología espermática a través de muestras fijadas en glutaraldehído, el veterinario tendría que preparar una muestra adicional siguiendo sus instrucciones y se podría transportar a temperatura ambiente. Sería deseable que la valoración de la MM se hiciera en campo, para que en el caso de que su valoración fuera mala, se pudiera decidir la repetición de una nueva colecta.
Para el transporte de las muestras de semen diluido se plantea hacerlo en refrigeración a 5°C y a ser posible, en una nevera con control digital de temperatura. Con el fin de que el descenso de la temperatura del semen diluido sea gradual, se aconseja que, con anterioridad a su introducción en la nevera, los microtubos se alojen en tubos de 50 ml que llevarán incorporada agua a 25°C. En la Figura 25 se puede apreciar el procedimiento de transporte propuesto.
Figura 25. Nevera y sistema de transporte para las muestras de semen diluido
Criterio de valoración
Antes de proceder a la interpretación de los parámetros de calidad seminal obtenidos por este protocolo 2, habría que verificar si los umbrales fijados para los parámetros seminales en el semen valorado después de la colecta (protocolo 1), deberían ser corregidos por el posible efecto del tiempo postcolecta y de la temperatura de refrigeración.
Para responder a esta cuestión, muestras de semen obtenidas por electroeyaculación de 35 toros de raza Asturiana de los Valles y diluidas inicialmente en Bioxcell (semen:diluyente) 1:1, fueron analizadas a las 0 horas poscolecta y después, tras 6 y 24 horas de refrigeración a 5°C. La MP fue valorada con el sistema CASA ISAS de Proiser® y la morfología espermática a través de una tinción con eosina nigrosina.
En la Tabla 7 se presentan los resultados de este estudio. Las horas poscolecta 0, 6 y 24 no generaron diferencias significativas en la normalidad espermática. Sin embargo, las muestras valoradas a 24 horas vieron reducida su MP con respecto a las muestras valoradas a 0 y a 6 horas. Aunque hubo una reducción de MP a las 6 con respecto a las 0 horas, esta diferencia no llegó a ser significativa. En el estudio se pudo comprobar además que el efecto de las horas postcolecta sobre la MP no fue similar entre toros (García-Paloma, et al., 2021).
Tabla 7. Efecto de las horas poscolecta en que se mantuvo el semen refrigerado a 5°C, sobre la normalidad y sobre la motilidad espermática progresiva
A la luz de estos resultados concluimos que los umbrales propuestos de normalidad espermática para el semen valorado poscolecta según el protocolo 1 se pueden aplicar también a las muestras de semen que se hayan mantenido hasta 24 horas en refrigeración. Sin embargo, la variabilidad de respuesta observada entre toros respecto al efecto de las horas de refrigeración sobre la MP, impide establecer un criterio de corrección que permita aplicar los umbrales propuestos para el semen valorado postcolecta. Como alternativa y a sabiendas de perder precisión cuando se valora la MP en semen refrigerado, proponemos el siguiente criterio.
Como ya fue comentado para semen valorado poscolecta, el sistema SFT propone un umbral del 30% para considerar un semen Apto por su MP, mientras que los sistemas WCABP y BCVA suben el umbral al 60%. El sistema SFT justifica esta menor exigencia asumiendo la dificultad para controlar los factores que pueden incidir negativamente sobre la MP cuando el semen es valorado en campo. Partiendo del supuesto que los veterinarios que aplican el protocolo 2 tienen una alta cualificación en la colecta y en la manipulación posterior del semen, y que el único factor que va a incidir negativamente sobre la MP va a ser el tiempo de refrigeración, proponemos que sea suficiente con que la MP sea ≥30% para considerar el semen Apto por este parámetro. Los toros con MP inferior al umbral mencionado serían descartados. Para la valoración de la MP en semen refrigerado recomendamos la tecnología de análisis de imagen CASA, ya que la valoración subjetiva por su baja precisión puede ser arriesgada en toros cercanos al umbral de descarte.
Cuando se valore la aptitud reproductiva de los toros de una ganadería, independientemente del protocolo utilizado, la valoración Seminal se hará una sola vez en la vida reproductiva del toro, preferiblemente antes del inicio de su primer año de cubrición. Se parte del supuesto que mientras no haya anomalías de índole sanitario o limitaciones de carácter nutricional, la calidad seminal del toro no debería cambiar con los años. La categoría asignada para la motilidad progresiva y para la normalidad espermática, se mantendrá a la hora de valorar la aptitud reproductiva del toro en años posteriores, excepto en aquellos casos donde se justifique una nueva valoración por una sospecha de bajada en fertilidad.